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生命科学的进展日新月异，在培养创新型人才的背景下，《细胞生物学实验技术教程（第四版）》在第三版的基础上，补充更新了实验，并整合成8章，共56个实验。**章详细介绍了显微镜技术；第二章到第七章涵盖了细胞器的形态与结构、细胞培养与DNA提取、细胞工程与转基因技术、转基因细胞的检测、细胞电生理技术及细胞的生命活动与调节，各章均有实验目的、实验原理、结果与分析及思考题等；第八章立足于《细胞生物学实验技术教程（第四版）》实验的总结和对学生综合创新能力的培养，提出了综合实验的设计原则和指导思想，并尝试给出了4个综合实验的例子。

目录

第四版前言

第三版前言

**章 显微成像技术 1

实验1.1 普通复式显微镜 1

实验1.2 相差显微镜和微分干涉显微镜 11

实验1.3 荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜 15

实验1.4 电子显微镜 19

实验1.5 电子显微镜样品制备 24

第二章 细胞及细胞器的形态与结构 34

实验2.1 质膜的通透性和水孔蛋白通透效应的观察 34

实验2.2 植物细胞质膜的分离和纯化技术 38

实验2.3 离心技术与叶绿体和细胞核的分离 41

实验2.4 核酸（DNA和RNA)的细胞核定位观察 44

实验2.5 细胞质骨架的光学显微镜观察——考马斯亮蓝染色 46

实验2.6 微丝骨架的特异性标记 48

实验2.7 转基因GFP-tubulin拟南芥的无菌培养及观察 50

实验2.8 果蝇中肠干细胞的形态与观察 53

实验2.9 线粒体的观察 55

实验2.10 线粒体的特异性荧光标记观察 58

第三章 细胞培养与DNA制备 61

实验3.1 细菌质粒的提取和分析 61

实验3.2 酵母细胞的培养、计数与观察 67

实验3.3 酵母DNA的提取 70

实验3.4 线虫DNA的提取 72

实验3.5 植物悬浮细胞的培养 74

实验3.6 植物基因组DNA的提取和分析 76

实验3.7 果蝇S2细胞的培养与转染 79

实验3.8 果蝇基因组DNA的提取 83

第四章 细胞工程与转基因技术 86

实验4.1 酵母细胞的乙酸锂（LiAc)转化 86

实验4.2 HeLa细胞的传代培养 93

实验4.3 脂质体介导的外源基因转染HeLa细胞 94

实验4.4 植物原生质体的制备及基因的瞬时转化 97

实验4.5 细胞的融合 100

实验4.6 农杆菌介导的叶盘法转化烟草 103

实验4.7 转基因拟南芥的创建 109

实验4.8 基因枪转化技术 111

第五章 转基因细胞的检测 117

实验5.1 植物组织总RNA的提取 117

实验5.2 RNA的定量和完整性分析 119

实验5.3 转基因细胞的RT-PCR检测 121

实验5.4 SDS-PAGE和蛋白质分子质量的测定 124

实验 5.5 Western杂交 130

实验5.6 凝胶阻滞分析 134

实验5.7 免疫共沉淀技术 138

实验5.8 荧光素酶报告基因的检测 140

第六章 细胞电生理技术 142

实验6.1 非损伤微测技术简介和H+微电极的操作 143

实验6.2 蟑螂巨大神经和空气振动感受器 148

实验6.3 电压钳系统和膜片钳技术 152

实验6.4 骨骼肌收缩综合实验 154

实验6.5 神经干电生理实验 159

实验6.6 蟾蜍心搏描记实验 164

实验6.7 蛙类心脏的神经支配 168

第七章 细胞的生命活动与调节 172

实验7.1 酵母异源功能互补的功能鉴定 172

实验7.2 质膜蛋白分选的膜泡运输观察 177

实验7.3 植物细胞胞吞作用及内膜系统的荧光显微镜观察 181

实验7.4 HeLa细胞有丝分裂的形态观察 185

实验7.5 植物细胞程序性死亡的诱导和梯状DNA的观察 187

实验7.6 流式细胞仪观察细胞周期 190

第八章 细胞生物学综合探究实验 195

实验8.1 细胞生物学综合探究实验设计举例 195

实验8.2 植物细胞探究性实验设计方案举例 197

实验8.3 动物细胞探究性实验设计方案举例 197

实验8.4 基因实验设计方案举例 198

主要参考文献 202

附录 206

彩图

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**章 显微成像技术

　　生物学，尤其是细胞生物学的许多重大发现与显微技术的不断创新、发展分不开。没有显微镜的发明就不会有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立。同样，如果没有电子显微镜的发明，人们就不会认识到细胞内部结构的复杂性。因此，显微成像技术是生物学研究领域中一项常规的、不可缺少的技术手段之一。

　　从英国物理学家Hooke创制了**架具有科学研究价值的显微镜到现今光、机、电一体化的各种高档显微镜已有350多年的历史了。为适应不同需要，目前有各种类型的显微镜，如可直接进行解剖及观察并具有立体感的体视显微镜；能观察活细胞的相差显微镜、微分干涉显微镜；对于双折射物质进行结构研究的偏光显微镜；既能作形态观察，又能作定位、定性分析的荧光显微镜；组织培养不可缺少的长工作距离的倒置显微镜；具高分辨率、可进行显微断层扫描的激光扫描共聚焦显微镜等。2014年诺贝尔化学奖授给了埃里克 贝齐格（Eric Betzig）、威廉 莫纳（William E.Moerner）和斯特凡 黑尔（Stefan W.Hell），其主要的贡献有：①超高分辨率光学显微镜STORM，使得在纳米量级分辨率上对细胞和组织成像；②单分子荧光显微镜成像技术，这是显微成像技术的巨大革命。

　　本章概述了几种常用的光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和电子显微镜的原理、结构特点、应用及获得*佳观察及采集图像效果的实践要点。

　　实验1.1普通复式显微镜

　　【实验目的】

　　1.学习普通复式显微镜的使用。

　　2.熟练掌握显微镜的操作。

　　【实验原理】

　　普通复式显微镜，即明场显微镜（bright field microscope，BF），可以说是*常用的一种显微镜，主要由3部分构成：①光学成像系统，由物镜和目镜组成；②照明系统，包括光源和聚光器；③机械装置，包括镜座、镜臂及载物台等，用于固定材料，观察方便。高级研究用显微镜往往还配有显微照相系统。根据照明系统和光学成像系统在显微镜中的相对位置不同，显微镜可以分为正置显微镜、倒置显微镜及体视显微镜（图1.1.1）。

　　正置显微镜是指光源和聚光镜等照明系统在载物台的下方，而物镜在载物台上方的一种显微镜。由于其工作距离相对较短，因而适合于观察放置在载玻片上的样品。

　　图1.1.1 Zeiss体视显微镜（A）、正置显微镜（B）和倒置显微镜（C）（Zeiss提供）

　　倒置显微镜和正置显微镜相比刚好相反，其物镜、聚光镜和光源的位置均颠倒过来，故称为倒置显微镜。由于其具有较长的工作距离，因此除了载玻片之外还可用于生物学中的组织及原生质体培养、浮游生物检验及流质沉淀物等的观察和研究。有的标本要求其工作距离更长的超长工作距离的聚光镜。为了达到较好的观察和成像效果，一般要求使用皿底为0.17mm厚度玻璃的专用培养皿。

　　体视显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”，是一种具有正像立体感的仪器，其双目镜筒中的左右两光束不是平行的，而是具有一定的夹角（体视角一般为12°~15°），因此，成像具有三维立体感。像是直立的，便于操作和解剖，这是由目镜下方的棱镜把像倒转过来导致的。放大率**为200倍左右，但其工作距离长，有的体视显微镜在物镜前加上0.5X附加镜后，工作距离更长，便于操作。焦深大，易于观察标本的断层，具三维结构。视场直径大，配上荧光装置和自动数字照相系统，可直接对大样品进行荧光观察、图像采集及分析。体视显微镜标准物镜的倍率为1X，为了改变它的倍率还附有几种不同倍率的附加物镜，如2X、0.75X、0.5X、0.3X等，以适应不同样品镜检要求。

　　图1.1.2 显微镜的成像原理图

　　（一）普通复式显微镜的成像系统

　　如图1.1.2所示，显微镜主要由两组放大系统组成，一组为焦距很短的物镜，另一组为焦距较长的目镜。为了减少像差，显微镜的目镜和物镜各由多组透镜构成，其中物镜的构造尤为复杂，有的由16个透镜组成。为了便于说明，图中的物镜和目镜都简化为单透镜。物体AB位于物镜的前焦点外但很靠近焦点的位置上，首先经过物镜形成放大的倒立实像这个像位于目镜的物方焦距内但很靠近焦点的位置上，作为目镜的物体。目镜将物镜放大的实像又二次放大成虚像A"B"，位于观察者的明视距离（距人眼250mm）处，供眼睛观察。在视网膜上形成的是实像A"B"。

　　由于显微镜所要观察的标本往往几何尺寸很小，小至可与光波的波长相比较；根据光的电磁波理论，此时不能再近似地把光线看成是直线传播，而要考虑衍射的影响。因此显微镜的成像过程是个比较复杂的衍射相干过程。由于衍射因素的影响，显微镜的分辨能力和放大率都受到一定限制。因此，常规的光学显微镜一般*小可观察到0.2/μm左右的标本，有效放大率**为1500~1600倍。

　　（二）普通复式显微镜的照明系统

　　英国人，爱德华 尼尔逊（Edward Nelson）根据阿贝原理，发明了临界照明法（critical illumination）或称尼尔逊照明法（Nelson illumination）。原理是利用阿贝聚光器，将光源的发光体形状的像聚焦于样品平面上，使样品能接受**亮度的照明，故称临界照明。这个方法多用于自然光，这种显微镜一般装置较简单，不具备视场光阑及孔径光阑，随着钨丝灯的发明后，这种照明法就逐渐被改进，但因钨丝灯的发光体形状是条状，聚焦于样品平面上，有灯丝的部分明亮，其他地方则暗，使照明不均匀。

　　柯勒照明系统是1893年，德国的一位年轻的动物学家柯格斯 柯勒（August Kohler）在临界照明法的基础上改良的照明法，是在聚光器与光源之间，加上一个光源聚光器（lamp condenser）及视场光阑（field diaphragm）。利用光源聚光器将光源发光体形状的像聚焦于孔径光阑的平面上，而聚光器将视场光阑的像聚焦于样品平面上（图1.1.3）。这样，无论光源灯丝形状如何，视场光阑均受到*亮、*均匀的照明，并且样品平面上照明区的大小和位置可以通过调节视场光阑的大小和位置来调控。柯勒照明的优点在于可使较小的钨丝灯达到更高的照明亮度，光源的光束尽量利用，减少了内部散射光，而且控制了反差和深度，*重要的是样品能得到平均照明，这在显微照相中至关重要（图1.1.3）。

　　图1.1.3 柯勒照明成像光路图（A）及柯勒照明发照明光路

　　a.真实像；b.目镜；c.目镜光阑；d.物镜后焦面；e.物镜；f.标本；g.聚光镜；h.孔径光阑；i.视场光阑；j.光源聚光镜；k.灯丝

　　（三）显微镜的主要光学技术参数

　　显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、总放大率、焦深、视场宽度、复盖差、工作距离、图像亮度、视场亮度。每个参数本身都有一定的合理极限，同时它们之间是相互联系又相互制约的，并不是每个参数越高越好。这些参数有的标在光学部件上，使用时应根据实验的目的和实际需要，充分考虑显微镜的各项技术指标及参数的关系，合理选择及调节好显微镜各个部件，只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，获得满意效果。

　　1.数值孔径

　　数值孔径（numerical aperture）又称“镜口率”，简写NA或A，一般标刻在物镜和聚光镜的外壳或转盘上（图1.1.4）。数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，尤其物镜的数值孔径大小是判断显微镜性能高低的重要标志。物镜的数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（〃）和孔径角（2〃）半数的正弦之乘积，用公式表7K为：NA=7zsim/。

　　孔径角又称“镜口角”（图1.1.4），是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通量就越大。它与物镜前透镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。

　　图1.1.4 物镜的数值孔径与孔径角

　　A.盛仙永拍摄；B.印莉萍，2005

　　干燥系物镜，因物镜前透镜与被检物体之间的介质为空气，空气的折射率为1，孔径角小于180°（否则物镜的工作距离等于零，无法工作），因此，干燥系统的物镜的NA值始终小于1。

　　基于这一原理，若想增大NA值，由于孔径角是无法增大的，**的办法是用较大折射率的介质，如水的折射率为1.333，香柏油的折射率为1.515。因介质的折射率值大于1，NA值就能大于1，故水浸系物镜的NA值**约为1.2，浸油系物镜NA值**可达1.45。

　　聚光镜的类型不同，其NA值的大小也不同，一般说来为0.05~1.4，它可通过调节孔径光阑的大小来改变NA值的大小，从而达到与物镜NA值相匹配的使用效果。有的聚光镜还可以把上透镜推出光路，即摇出摇入式聚光器，当低倍镜检时将上透镜摇出光路，NA值则下降。当换成高倍物镜时，将上透镜推入光路。

　　为了充分发挥物镜数值孔径的**作用，注意调节聚光镜的孔径光阑。一般观察时，使其数值孔径NA值等于或大于物镜的NA值，在显微照相及数码采集时，则应小于物镜的NA值。

　　数值孔径还与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数，它与分辨率成正比，与放大率（有效放大率）成正比，与焦深成反比，NA值的平方与图像亮度成正比，NA值越大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。

　　2.分辨率

　　显微镜的分辨率（resolution）是指两点能清楚分开的极限距离。在显微镜的设计中，规定当一个圆斑像的圆心刚好落在另一个圆斑像的圆周上，则认为两物点的像刚刚能够被分开，如图1.1.5所示，就是分辨的*小距离。

　　分辨率的大小决定了显微镜分辨试样上细节的程度，具有高分辨率的高质量的物镜是产生清晰准确图像的关键。因显微镜的物镜是使物体放大成一倒立实像，目镜的作用是使这个实像再次放大；这就是说目镜只能放大物镜已分辨的细节，物镜未能分辨的细节绝不会通过目镜放大而变得可分辨。因此，显微镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率。

　　物镜分辨率的表达式如下：

　　D=0.61λ/NA

　　式中，A为入射光的波长，NA为物镜的数值孔径。由表达式可知，对于一定波长的人射光，物镜的分辨率完全取决于物镜的数值孔径，即数值孔径越大，分辨率越高。

　　在显微镜下看到的图像，不论是什么结构，都可以看作由亿万个物体点组成，各点的颜色、位置、亮度各有不同。由于光波的衍射特性、光学系统残留的像差、玻璃的质量及杂散光等多种因素的影响，每个物体点经物镜成像后，不可能是一个清晰的点像，而是呈现一定大小衍射斑的弥散圆像。这种衍射效应严重阻碍分辨率的提高。

　　3.放大率

　　放大率（magnification）就是放大倍数，是指被检物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的*终图像的大小与物体原大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积，即总放大率=物镜放大率×目镜放大率。物镜和目镜的放大倍数均标刻在其外壳上。

　　显微镜的放大倍数是指长度的放大，而不是指面积的放大。例如，1μm的物体，在显微镜下放大100倍，则长度为100μm，若以面积计算，则为10000μm2。

　　显微镜的放大率存在一定限度。其*适当的总放大率，原则上是在标准筒长下，所使用的物镜NA值的500~1000倍，这个范围内的总放大率称为“有效放大率”或“合理放大率”；超越这个范围的放大率则称为“无效放大”或“空虚放大”。观察时应在有效放大率的范围内来选择物镜和目镜的配合。例如，使用NA为1.4（100X）的物镜时，应在700~1400倍放大率的范围内选用目镜的放大倍数，即7X~14X的目镜比较合适。若用5X的目镜则达不到人眼所能分辨的大小；用15X或20X的目镜则为无效放大。因此在观察时，一般使用10X的目镜为好。高级的研究用显微镜常只配一对10X的目镜。10X目镜为“标准目镜”。作高倍镜检时，应首先考虑更换物镜，而不要盲目更换过高倍率的目镜。

　　4.焦深

　　焦深

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