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《分子细胞生物学实验指导》是我校国家特色专业——水产养殖专业课程建设的成果之一。《分子细胞生物学实验指导》内容分两篇，**篇为细胞生物学技术，包括细胞的形态结构观察、细胞生理生化技术、细胞培养和细胞工程技术等；第二篇为分子生物学技术，包括基因组DNA 的提取、基因克隆技术和蛋白质分析技术等。较完整地介绍了目前在水产领域研究中应用的分子和细胞生物学技术，各篇内容既涵盖基础性的实验，又包括综合性的实验，在学生掌握实验技术的基础上，培养学生对实验结果的分析能力。为结合专业特点，《分子细胞生物学实验指导》侧重以水产生物为实验材料。

目录

前言

**篇 细胞生物学技术

实验1 细胞形态观察及显微测量 3

实验2 光学显微标本的制备与观察 5

实验3 相差和荧光显微镜的使用 9

实验4 透射电子显微镜及细胞超微结构观察 13

实验5 扫描电子显微镜及细胞表面结构观察 16

实验6 细胞骨架的观察 18

实验7 细胞核和线粒体的分离及鉴定 20

实验8 叶绿体的分离与观察 22

实验9 细胞膜的通透性 25

实验10 植物凝集素对红细胞的凝集作用 27

实验11 细胞电泳 29

实验12 细胞吞噬的观察 32

实验13 鱼类血细胞微核的诱导 34

实验14 细胞内DNA及RNA的显示 37

实验15 动物细胞原代培养 39

实验16 动物细胞传代培养 43

实验17 原生质体的分离和培养 48

实验18 细胞凋亡的诱导和检测 51

实验19 细胞融合的诱导 53

实验20 重金属离子对鱼类细胞活性的影响 57

实验21 动物骨髓细胞染色体的制备 59

实验22 鱼类精子的超低温冷冻保存 62

实验23 单细胞凝胶电泳 64

实验24 荧光原位杂交 67

第二篇 分子生物学技术

实验25 鱼类基因组DNA的提取 73

实验26 植物基因组DNA的提取 77

实验27 细菌基因组DNA的提取 83

实验28 DNA酶切及凝胶电泳 86

实验29 Southern杂交 89

实验30 基因的PCR扩增 95

实验31 感受态细胞的制备 98

实验32 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 100

实验33 PCR扩增产物的纯化及克隆 103

实验34 RNA的提取与检测 107

实验35 逆转录PCR法检测基因的表达 111

实验36 cDNA克隆及原核表达 114

实验37 重组蛋白的检测 117

实验38 Northern杂交 121

实验39 RACE技术 125

实验40 定量PCR技术 130

实验41 应用基因枪法进行藻类遗传转化 136

实验42 农杆菌介导的植物遗传转化技术 140

实验43 基因组步移 146

实验44 启动子功能分析 149

实验45 蛋白质双向凝胶电泳 153

实验46 同工酶电泳分析 159

参考文献 163

附录实验室规则 164

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实验1 细胞形态观察及显微测量

【实验目的】

学习和掌握在普通光学显微镜下测量细胞大小的方法。

【实验原理】

细胞长度、面积、体积的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。

在显微镜下用来测量细胞长度的工具叫显微测量计，由目镜测微尺(ocularmicrometer)和镜台测微尺(stage micrometer)组成，两尺要配合使用。目镜测微尺是放在目镜内的一直径为2cm的圆形玻片，圆形玻片正中央有100等分格的刻度尺。

每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而不同。镜台测微尺是一块特制的载玻片，在它的中央由一片圆形盖片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺全长为lmm，分为l00 等份的小格，每小格的长度为0.0lmm(10μm)，标尺的外围有一小黑环，便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。

【实验材料、器具和试剂】

1. 材料鲫鱼、蛙和人血涂片。

2. 器具显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺。

【实验步骤】

1. 细胞大小的测量

(1) 取下目镜，将目镜测微尺的刻度面向下放入目镜内的视场光阑上，再旋上目镜。

(2) 将镜台测微尺盖片面朝上放在载物台上，用低倍镜观察，调节焦距看清镜台测微尺的刻度。

(3) 移动镜台测微尺，同时转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，并将两尺的“0”点刻度线或某刻度线对齐。然后从左向右查看两尺刻度线另一重合处，分别记录重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。以下式计算目镜测微尺每小格表示的实际长度：目镜测微尺每小格实际长度=镜台测微尺格数×10 μm/目镜测微尺格数(4) 移去镜台测微尺，换上不同生物的血涂片，用目镜测微尺测量细胞所占小格数并乘以目镜测微尺每小格代表的实际长度，即为被测细胞的实际长度。如果细胞是椭圆形的，分别测量其长径和短径。

2. 厚度测量法测量细胞的厚度，简便的方法是利用显微镜上的微调焦轮上的标尺对细胞厚度进行测量。先将焦点面与被测物体的上端对齐一致，记下轮上的刻度数，然后旋转微调焦轮，使焦点面与下端对齐一致，再记下刻度数，两者之差，便是所测物体的厚度。此法简单但不精确。

3. 观察细胞及细胞器的形态结构观察和比较这三种不同生物血细胞

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书籍介绍

《分子细胞生物学实验指导》是我校国家特色专业——水产养殖专业课程建设的成果之一。内容分两篇，第一篇为细胞生物学技术，包括细胞的形态结构观察、细胞生理生化技术、细胞培养和细胞工程技术等；第二篇为分子生物学技术，包括基因组DNA的提取、基因克隆技术和蛋白质分析技术等。较完整地介绍了目前在水产领域研究中应用的分子和细胞生物学技术，各篇内容既涵盖基础性的实验，又包括综合性的实验，在学生掌握实验技术的基础上，培养学生对实验结果的分析能力。为结合专业特点，《分子细胞生物学实验指导》侧重以水产生物为实验材料。 可供水产专业、生命科学相关专业本科生和研究生使用，也可作为相关研究人员的参考书。