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现代分子生物学技术与实验技巧系统介绍了现代分子生物实验技术。第1~6章包括质粒的提取和目的基因的获得、基因的克隆和重要分子的筛选以及目的基因的表达和检测；第7~14章涉及近年来发展起来的一些新技术，包括报告基因分析、差异基因表达谱分析、蛋白质-核酸相互作用技术、蛋白质-蛋白质相互作用技术、细菌体内同源重组技术、转基因动物、基因打靶技术和流式细胞术；第15~17章介绍了一些新的分子生物学研究技术，包括干细胞的分离培养与诱导分化技术、小RNA的构建及实验技术、非编码RNA数据库及在线分析工具。

本书强调对实验结果作具体分析，每个实验结果都附图或照片，图中设阴阳性对照，对照图对实验结果进行详细分析，使读者对实验结果一目了然，本书还指出了每个技术的难点和解决的办法。

本书是生物、医学及相关实验室***的工具书，适合于从事生命科学研究和教育的科技工作者和教师，更适合于从事生命科学研究的硕士和博士研究生参考阅读。

章分子生物学技术概述1

一、引言1

二、目的基因的获取1

三、克隆载体的构建和选择2

四、载体的转化2

五、重组子的筛选3

六、基因表达4

七、生物工程技术的应用5

参考文献6

第二章核酸提取技术7

节质粒DNA的提取7

一、引言7

二、碱裂解法小量质粒提取所需的仪器、材料及基本步骤8

三、Promega质粒DNA小量提取试剂盒操作程序9

四、注意事项10

五、实验结果说明10

六、疑难解析10

第二节基因组DNA的提取12

一、引言12

二、从植物组织提取基因组DNA13

三、从动物组织提取基因组DNA14

四、细菌基因组DNA的制备15

五、用DNA提取试剂盒从全血和组织中提取基因组DNA15

六、注意事项17

七、实验结果说明18

八、疑难解析18

第三节RNA的提取19

一、引言19

二、实验设计思路和基本步骤20

三、实验结果说明24

四、疑难解析24

参考文献25

第三章目的基因的获取及鉴定技术27

节普通PCR27

一、普通PCR的基本概念和原理27

二、普通PCR技术的实验方法28

三、疑难解析33

第二节实时荧光定量PCR34

一、实时荧光定量PCR的基本概念和原理34

二、实时荧光定量PCR的定量方法38

三、荧光定量PCR的实验方法43

四、荧光定量PCR技术的应用48

五、疑难解析54

第三节环介导恒温扩增法快速检测病原菌57

一、引言57

二、环介导恒温核酸扩增的原理58

三、实验设计思路和基本步骤60

四、实验结果68

五、疑难解析69

六、小结72

参考文献74

第四章载体的构建和鉴定78

节克隆载体78

一、pBR322载体78

二、pUC8——一种Lac选择型质粒80

三、pGEM3Z——克隆DNA的体外转录80

四、柯斯质粒载体81

第二节表达载体82

一、原核表达载体82

二、真核表达载体84

第三节载体构建中的关键工具和步骤90

一、关键工具90

二、关键步骤91

第四节载体构建的应用举例93

一、实验材料93

二、实验方法94

参考文献98

第五章细菌转化与细胞转染技术100

节细菌转化100

一、基本原理100

二、实验设计思路和基本步骤101

三、实验结果及分析102

四、疑难解析102

第二节细胞转染104

一、基本原理104

二、实验设计和基本步骤107

三、实验结果及分析108

四、疑难解析109

参考文献110

第六章外源基因表达的鉴定112

节Northern Blot112

一、引言112

二、实验设计思路和基本步骤112

三、实验结果说明115

四、疑难解析116

第二节RTPCR116

一、引言116

二、实验设计思路和基本步骤117

三、实验结果说明119

四、疑难解析119

第三节Western Blot120

一、引言120

二、实验设计思路和基本步骤120

三、实验结果说明125

四、疑难解析125

第四节ELISA126

一、引言126

二、实验设计思路和基本步骤128

三、实验结果说明130

四、疑难解析131

参考文献132

第七章报告基因分析134

节报告基因的定义和种类134

一、报告基因的定义134

二、常用的报告基因134

第二节应用报告基因分析基因的转录活性135

一、实验原理135

二、实验设计和基本步骤136

三、实验结果分析137

四、疑难解析139

第三节报告基因在动物活体成像中的应用140

一、实验原理140

二、实验设计和基本步骤142

三、实验结果分析143

四、疑难解析144

参考文献145

第八章差异基因表达谱分析147

节基于双向电泳技术的蛋白质组学分析147

一、引言147

二、实验基本步骤和注意事项147

三、双向电泳实验结果说明及疑难解析154

四、质谱数据分析说明及疑难解析154

五、结语160

第二节基因芯片160

一、引言160

二、工作原理161

第三节基因芯片的制备163

一、概述163

二、探针的选择和制备164

三、基因芯片基片的选择和准备165

四、基因芯片的制作166

第四节基因芯片的检测168

一、基因芯片的杂交和数据获取168

二、基因芯片分析常用的软件和数据库170

第五节基因芯片的应用171

一、基因芯片与病原微生物检测171

二、基因芯片与肿瘤172

三、基因芯片与药物研发174

四、结束语176

参考文献177

第九章蛋白质核酸相互作用技术178

节凝胶迁移实验178

一、引言178

二、实验设计与基本步骤179

三、实验举例与结果说明184

四、需要注意的问题186

第二节染色质免疫共沉淀技术187

一、引言187

二、实验基本步骤188

三、实验举例190

四、实验注意事项191

第三节RNA沉降192

一、实验基本原理192

二、实验基本思路193

三、实验举例说明198

参考文献199

第十章蛋白质-蛋白质相互作用技术200

节运用酵母双杂交技术筛选与靶蛋白相互作用的蛋白质200

一、引言200

二、实验设备及材料201

三、实验设计流程202

四、实验方法202

五、实验结果说明208

六、疑难解析212

第二节GST沉降213

一、实验基本原理213

二、实验基本步骤213

三、实验举例216

四、实验注意事项220

第三节免疫共沉淀221

一、引言221

二、实验设计和基本步骤222

三、实验结果举例223

四、需要注意的问题226

第四节细胞共定位226

一、引言226

二、实验设计和基本步骤227

三、实验结果举例说明227

四、实验注意事项229

参考文献229

第十一章微生物体内同源重组技术231

节传统的大肠杆菌体内同源重组方法（RecA重组系统）231

一、引言231

二、利用RecA重组系统构建痢疾杆菌hns基因插入突变体231

三、RecA重组系统构建突变体的其他方法234

四、存在的问题和解决方法235

五、小结235

第二节Red/ET重组系统236

一、引言236

二、痢疾杆菌酸hns基因缺失突变体的构建237

三、Red同源重组技术应用策略239

四、应用Gap-Repair克隆技术构建pBR322-Red载体241

五、Red/ET重组系统的其他应用244

六、小结244

参考文献244

第十二章转基因动物技术246

节转基因动物概述246

一、转基因动物的概念246

二、转基因动物的分类246

三、转基因动物的命名247

四、转基因动物的基本原理248

五、转基因动物的安全性和伦理学问题249

六、转基因动物技术的发展概况250

第二节显微注射法制备转基因动物251

一、仪器设备及材料251

二、实验动物准备252

三、转基因动物制备方法253

四、影响转基因动物效率的因素256

第三节利用ES细胞制备转基因动物257

一、ES细胞的研究历史257

二、ES细胞的生物学特性257

三、ES细胞分离培养的基本方法258

四、ES细胞的遗传修饰262

五、转基因制备269

参考文献270

第十三章基因打靶技术271

一、基因打靶技术的原理271

二、利用同源重组构建基因打靶动物模型的基本步骤272

三、基因打靶的策略274

四、基因打靶的生物学意义和应用前景286

参考文献287

第十四章流式细胞术实验方法291

一、引言291

二、实验方法294

三、实验结果分析299

四、流式细胞分析的质量控制309

参考文献311

第十五章干细胞的分离培养与诱导分化313

节人胎盘来源间充质干细胞的分离培养与纯化313

一、引言313

二、材料、试剂与主要仪器设备314

三、实验方法315

四、实验结果318

五、注意事项321

第二节小鼠间充质干细胞的分离培养与纯化324

一、引言324

二、骨髓法325

三、密质骨法325

第三节人胚胎干细胞的培养334

一、引言334

二、实验材料335

三、实验方法335

四、注意事项339

第四节CD34+造血干细胞与CD14+单核细胞向树突状细胞的诱导分化339

一、引言339

二、实验材料与方法340

三、实验结果343

四、注意事项345

参考文献346

第十六章小RNA的构造及实验技术351

节miRNA克隆351

一、材料与设备352

二、实验方法352

三、疑难解析355

第二节miRNA Northern Blot355

一、材料与设备355

二、实验方法356

三、疑难解析357

第三节miRNA原位杂交357

一、材料与设备357

二、实验方法358

三、疑难解析359

第四节基于poly(A)加尾的miRNA RT-PCR359

一、材料与设备359

二、实验方法360

三、疑难解析361

第五节miRNA功能研究362

一、miRNA表达检测362

二、miRNA功能筛选鉴定362

三、miRNA靶基因鉴定364

第六节siRNA的构造及实验研究365

一、引言365

二、如何进行siRNA实验368

三、常用siRNA实验的基本步骤371

四、实验结果说明374

五、疑难解析376

参考文献376

第十七章非编码RNA数据库及在线分析工具介绍379

一、综合性非编码RNA数据库379

二、miRNA相关数据库及预测403

三、rRNA相关数据库及预测424

四、sRNA相关数据库及预测432

五、siRNA相关数据库及预测448

六、tRNA相关数据库及预测456

七、snoRNA相关数据库及预测471

参考文献478

叶棋浓，军事医学科学院生物工程研究所，研究员，医学分子生物学研究室主任。国家杰出青年科学基金和军队医学杰出人才基金获得者。总后勤部“科技银星”。。《World Journal of Clinical Oncology》、《Journal of Chinese Clinical Medicine》、《中国生物化学与分子生物学杂志》、《国际肿瘤学》等杂志编委。

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编辑推荐

鉴于在以往的相关书籍中缺乏对实验结果的详细分析，致使读者不易理解。所以本书强调对实验结果作具体分析，每个实验结果都附图或照片，图中设阴阳性对照，对照图对实验结果进行详细分析，使读者对实验结果一目了然，本书还指出了每个技术的难点和解决的办法。

前言

分子生物学是从分子水平对生物学进行研究的科学，自从现代分子生物学技术诞生以来，生命科学的发展得以大力推进，分子生物学技术在生物学、医学、农林业、制药学等多个领域得到了广泛的应用。该技术是目前从事生命科学研究的重要手段，是每个从事这个领域的科技工作者都必须熟练掌握的基本技能。

编写本书的目的在于弥补以往的书籍中对实验结果分析的缺乏，本书强调对实验结果作具体的分析，如需附结果的图或照片，图中要有阴阳性对照等。结合照片分析研究结果，列举实验中经常遇到的问题及可能的解决方法是本书的特色。读者阅后在实验结果解读和改进实验方法等方面都能豁然开朗。此外，本书在编写的内容上也力求全面，～六章包括分子克隆所需的技术，从基因的提取、克隆到目的基因的表达；第七～十三章分别介绍了包括双向电泳、蛋白质与核酸/蛋白质的相互作用、细菌体内DNA同源重组、基因打靶和转基因动物等；后三章则对小RNA、干细胞的分离培养与诱导分化技术以及非编码RNA数据库及在线分析工具进行了介绍。本书适用于所有从事生命科学研究的科技工作者、教师和研究生。

本书大多由工作在线的青年科技工作者和博士研究生撰写，由于时间仓促，加上编者水平有限，书中难免有疏漏和不妥之处，恳请读者指正。

叶棋浓

军事医学科学院生物工程研究所

2015年5月于北京