基因工程原理(第2版) 下载 pdf 百度网盘 epub 免费 2025 电子书 mobi 在线

《基因工程原理（第二版）》是作者在多年教学和科研经验的基础上参考大量文献精心编写而成，力求内容新颖，方法 ，脉络清晰，原理分明，术语规范，文图并茂。《基因工程原理（第二版）》除绪论外，共分9章：基因工程的分子遗传学基础，原核生物分子克隆的宿主和载体系统，基因文库的构建和筛选，基因组DNA的分析，聚合酶链反应与连接酶反应，培养细胞中克隆基因的表达，转基因动植物，人类基因鉴定和基因诊断，基因治疗。在每章后都配有习题，供读者练习，并在书后附有索引，供读者查阅。

绪论

　　基因工程(gene engineering)，也称为基因修饰(genetic modification)，是指按照人们的设计，用生物技术( biotechnology)直接操作生物的基因组。首先通过分离和拷贝目的基因或人工合成外源基因，在体外将外源基因插入到载体分子中，成为重组DNA，再导人宿主细胞内，进行扩增和表达。此过程所涉及的方法学称为重组DNA技术(recombinant DNA technolo-gy)，也称为分子克隆(molecular cloning)或基因操作(gene manipulation)。

　　通过基因工程技术改变了遗传物质的生物称为遗传修饰生物( genetically modified organ-ism，GMO)，也称为转基因生物(transgenic organism)。其实这两个概念是有差别的，转基因生物是指基因组中含有外源基因的生物，而遗传修饰生物除可能含有外源基因外，还包括基因组中的基因被修饰。例如，基因敲人(gene knockin)、基因敲除(gene knockout)、基因敲落(gene knockdown)、基因打靶(gene targeting)、外显子删除和定点突变(point mutation)等。所以遗传修饰生物的范围 为广泛。

　　基因工程通常不包括传统的动植物育种、体外受精、诱导多倍体、诱发突变及细胞融合技术。这些技术都不使用体外重组DNA。而欧盟委员会曾定义基因工程包括选择育种。

　　体细胞克隆( somatic cell cloning)和干细胞(stem cell)技术虽不属于基因工程，但和基因工程密切相关，常用于基因工程。特别是2007年山中伸弥成功地实现了诱导多能细胞(iPSC)以来，干细胞诱导已成为基因治疗中一种新的策略。

　　一、基因工程的理论和技术基础及工作程序

　　（一）基因工程所依赖的核心理论

　　基因工程所依赖的核心理论是：①1953年美国的J.D.Watson和F.H.C.Crick建立的DNA的双螺旋模型；②1946年美国的J.Lederberg等相继发现在细菌和噬菌体中遗传物质横向传递的一系列现象和规律；③1961年法国的F.Jacob和J.Monod建立的操纵子模型；④美国的M. W. Nirenberg(1964年)和H.G.Khorana(1967年)分别破译了全部有义密码子。

　　（二）基因工程所依赖的核心技术

　　基因工程所依赖的核心技木是：①1977年英国F.Sanger等建立的DNA测序技术；②一系列重要工具酶的发现，特别是1956年美国A.Kornberg发现DNA聚合酶；1966年B.Weiss和C.C.Richardson分离出DNA连接酶；1968年美国H. O. Smith发现Ⅱ类限制性内切核酸酶；1970年H. M. Temin等发现反转录酶；③1973年S.N.Cohen和H. W. Bover等建立的质粒转化技术；④1987年由美国的K.B.Mullis等建立的PCR体外扩增技术；⑤1989年M.R.Capecchi等建立的“基因打靶”技术等使基因工程 是如虎添翼；⑥基因组编辑核酸酶的应用，能够定位和准确修饰生物基因组，这为研究基因功能、基因治疗创造了新的途径。

　　（三）基因工程的工作程序

　　基因工程可分为五步：①“剪切”，即通过限制性内切核酸酶将目的基因交错切下，同时在 位置上切开载体分子。通过凝胶电泳分离目的基因。PCR技术也可用来分离和扩增目的基因片段。②“连接”。使用连接酶将切下的目的基因连接到载体分子中，产生重组DNA分子。③“转化”。将重组DNA分子导入能提供复制酶系的宿主活细胞中。④“扩增”。重组DNA分子在宿主细胞中通过白我复制增加拷贝数。⑤“表达和检测”。选择或鉴别含有重组DNA的宿主细胞，并以 的转录和翻译条件，以获得较多的基因产物。为了正常表达，基因插入到遗传修饰生物体需要和其他的基因元件组合。一个 入的基因主要的结构不仅含有启动子和终止子，还需要连锁选择标记基因。检测是用DNA印迹杂交(Southern blot hvbrid-ization)和DNA测序来检验生物体是否含有新基因。这些检测能探明外源基因插入的位置和拷贝数，也可用来定位和测量基因产物（RNA和蛋白质）。这些方法还包括RNA杂交( Northern hvbridization)、定量反转录PCR、蛋白质印迹(Western blot)、荧光免疫法、酶联免疫吸附实验(ELISA)及表型分析。

　　基因敲入是以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。基因敲除是将一个特地设计的DN 段导人生物体中，通过同源重组使靶基因被置换出而失活的实验技术。基因敲落是用反义技术、RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。基因打靶是用同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。基因组重编程是用基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸内切核酸酶(engineered meganuclease)、转录激活子样效应物(TALE)进行剪切。基因组编辑核酸酶也能用来介导内源基因的突变、损伤修复和敲除。

　　二、基因工程技术的建立与发展

　　（一）基因工程的建立

　　基因工程的产生是生命科学发展的必然。白从遗传学诞生之后，随着对基因功能不断深入的研究，人们不仅想了解基因，而且还希望能改变它们，从而提高农作物的产量，改善生物体的性状，甚至用来防治遗传缺陷。早在1927年，H.J.Muller就用X射线照射果蝇，诱导果蝇发生了突变。这是人类 次主动改变生物体基因，但这种诱变及诱变育种仅能提高基因的突变频率而不能按照人们的意愿改变基因突变的方向，得到预期的结果。

　　在20世纪60年代后期，分子遗传学的帷幕已经拉开，人们逐步掌握了微生物众多基因的功能，甚至可将噬菌体像手表一样的拆卸和组装。因此，一些遗传学家们误认为遗传学的发展已达到了“ 状态”，似乎很难有新的突破，因此有的遗传学家便改弦 张，转移到其他生命科学领域去寻找新的战机。例如，1955年建立了染色体的精细作图方法和互补测验，并提出了“顺反子”概念的美国 遗传学家S.Benzer于20世纪60年代后期改变了原来的研究方向，从事研究昆虫的神经生物学。此时，遗传学似乎已处在一个“山重水复疑无路”的状态。正当遗传学家们感到彷徨的时期，基因工程异军突起，石破天惊，震撼了整个世界，也冲击了人们的生活和观念，使遗传学的发展进入了一个“柳暗花明又一村”的新时代。

　　体外重组DNA这个设想首先是由斯坦福大学的P.Lobban于1970年提出的。1971年，R.H. Jensen等率先运用末端转移酶(terminal transferase)在试管中将寡聚“A”或寡聚“T”连接到DNA分子末端上；但这样的互补端还是无法以共价键连接。1972年，斯坦福大学昀P.Lobban和D.Kaiser采用噬菌体入的外切酶可回切噬菌体P22 DNA 5 7端而造成端突出(3，-extension)；他们运用核酸外切酶Ⅲ及DNA聚合酶工将噬菌体P22的两段DNA成功地连接了起来（论文发表于1973年）。

　　1972年，美国斯坦福大学的P.Berg采用了与P.Lobban等的相同方法，将猿猴病毒(sim-ian virus 40，SV40)的DNA和槛菌体的DN 段及大肠杆菌乳糖发酵相关基因（dvgal）的操纵子DNA三者进行了重接，开创了体外重组之先河，标志着一个新的科学时代的到来。由于此项杰除贡献，P.Berg获得1980年的诺贝尔化学奖。

　　P.Berg等的工作方法和策略与P.Lobban的 相同，所不同的是P.Lobban的工作是将同种生物的DNA进行了“体外连接”，称为顺化基因(cisgenic)连接，而不是转基因(trans-genic)重组，后者是指将不同物种的外源基因转入受体细胞的过程。而P.Berg等的工作是 在体外将不同物种的DNA进行了重组，与P.Lobban的工作相比，有了本质上的飞跃和升华。尽管如此，P.Lobban酌创新思维仍然是功不可没的。

　　1973年，S.N. Cohen和H. W. Boyer等用限制性内切核酸酶EcoRI切割含有抗四环素基因的质粒pSC101和来白鼠伤寒沙门氏菌的质粒RSF1010（带有抗链霉素和磺胺基因），用连接酶进行拼接，构建成一个新的 质粒。用它转化大肠杆菌后，转化子既能抗四环素，又能够抗链霉素，从而建立了转化技术。1974年，他们又将非洲爪蟾的DNA切成片段，连接到质粒pSC101上并转移到大肠杆菌中，使体外重组技术又向前推进了一步，基因工程技术从此诞生，遗传学也随之发生了新的飞跃，一个新的“基因工程”时代展现在人们的面前。虽然S.N. Cohen和H. W. Bover未能获得诺贝尔奖，可是他们的丰功伟绩在人们的心中建立了一座无形的丰碑。

　　（二）基因工程的发展

　　基因工程的发展可分为两个时期。20世纪70～90年代是转基因时代，通过转基因产生了转基因动、植物和生物反应器。此后便开始进入了基因工程发展的新时期，基因组测序、体细胞克隆、干细胞技术及基因修饰和重编程技术相继问世，将基因工程推向新高潮。

　　1.转基因植物

　　通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物体称为转基因植物( transgenic plant)，以植物作为生物技术的实验材料有其特定的优点，那就是植物细胞大部分都有全能性，可以用单个细胞分化发育出整个植株。这样，经过基因工程改造的单个植物细胞有可能再生成一棵完整的转基因植株。

　　1983年，美国的K.A.Barton等4组科学家们几乎同时开展了转基因植物的研究工作，利用Ti质粒将卡那霉素抗性基因转到烟草植物中，诞生了世界上 种转基因植物。此后，转基因植物的研究工作在世界各地蓬勃发展，对农作物的优良性状进行了大量深入的研究，培育了具有各种抗性的农作物，如抗病虫、抗除草剂、抗倒伏、抗寒、耐干旱、抗盐碱，并对人们梦寐以求的高光效、固氮等相关基因群进行了探索。科学家们也构建了生产外源基因表达产物的植物生物反应器，尝 转基因植物来生产人的生长激素、胰岛素、干扰素、白细胞介素Ⅱ、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等。随着基因工程技术的发展，越来越多的具有优良性状的转基因植物在 范围内得到广泛种植。

　　2.转基因动物

　　1974年，R.Jaenisch等用显微注射(microinjection)将SV40的DNA导入小鼠的囊胚( blastocyst)中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA，建立了世界上 例转基因动物。

　　1980年，美国的J.W. Gordon和F.H. Ruddle等采用原核显微注射( pronuclear microinjection)将疱疹病毒和SV40的DN 段 成功地注入小鼠受精卵原核中，获得了2只整合有外源基因的转基因小鼠，并杜撰了“转基因”( transgenic) -词，这种小鼠就被称为“转基因鼠”(transgenic mice，TG mice)，从而建立了转基因动物技术。

　　1982年，美国的R.D.Palmiter等用微注射法将大鼠素基因和小鼠的金属硫蛋白基因融合在生长激素(rGH)基因与小鼠金属硫蛋白(MT)基因启动子一起，通过显微注射注入侏儒型小鼠的连接后，导人小鼠受精卵中，并得到了表达，使小鼠发育成受精卵中，再将此受精卵移入假孕母鼠比正常小鼠大1倍的“ 小鼠”(super mouse)。并且，他们还提出了以转基因动物中提取药物蛋白的设想。这是外源基因 在动物体内得到表达（绪图-1）。

　　1983年，J.W. Gordon和F.H. Ruddle将携带了外源基因的动物

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书籍介绍

徐晋麟、陈淳、徐沁编著的《基因工程原理(第2版)》是作者在多年教学和科研经验的基础上参考大量文献精心编写而成，力求内容新颖，方法先进，脉络清晰，原理分明，术语规范，文图并茂。本书除绪论外，共分9章：基因工程的分子遗传学基础，原核生物分子克隆的宿主和载体系统，基因文库的构建和筛选，基因组DNA的分析，聚合酶链反应与连接酶反应，培养细胞中克隆基因的表达，转基因动植物，人类基因鉴定和基因诊断，基因治疗。在每章后都配有习题，供读者练习，并在书后附有索引，供读者查阅。

本书适合作为高等院校生物科学、生物技术、生

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